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β-內(nèi)酰胺類抗生素誘導(dǎo)革蘭氏陰性菌釋放內(nèi)毒素對其療效的影響
徐能武(解放軍第97醫(yī)院, 江蘇徐州221004) 袁建成 肖光夏 鄭江 秦孝建(重慶市西南醫(yī)院燒傷研究所, 重慶400038)
摘 要
探討β-內(nèi)酰胺類抗生素在誘導(dǎo)革蘭氏陰性菌釋放內(nèi)毒素(LPS)及對感染動物保護效能方面的差異,旨在為臨床上防治革蘭氏陰性菌感染時正確選擇抗生素提供實驗依據(jù)。
將Wistar大鼠背部做30%TBSA(Ⅲ°)燙傷,創(chuàng)面立即涂銅綠假單胞菌(PA103)懸液1ml(1× 109CFU),72h后制成大鼠燒傷創(chuàng)面膿毒癥模型。燒傷膿毒癥大鼠隨機分為單純抗生素治療組、半乳糖胺(GalN)敏化后治療組及愛蘭苔膠(CGN)封閉后治療組。分別用亞胺培南(IMP,5mg)和頭孢他啶(CTZ,10mg)單劑量腹腔注射(i.p.)治療,對照組施以等量無菌生理鹽水,同時,敏化組加用GalN 50mg i.p.,以增強大鼠對LPS的敏感性,封閉組在敏化組的基礎(chǔ)上加用CGN 1mg i.p.,以阻斷LPS的生物學(xué)效應(yīng)。于抗生素治療前及治療后3、6及9h抽靜脈血,檢測血中細菌濃度,血漿LPS水平,并觀察敏化組和封閉組大鼠10d后的死亡率。結(jié)果IMP和CTZ均能使大鼠血中菌量顯著降低;IMP和CTZ在殺菌過程中均能誘導(dǎo)PA103釋放大量LPS,但CTZ組血漿LPS水平顯著超過相應(yīng)的IMP組(P <0.05或P <0.01);與此同時,敏化組大鼠的死亡率CTZ組明顯高于IMP組(P <0.05),而在封閉組,兩者間的這種差異則消失(P>0.05)。
結(jié)果表明,同屬β-內(nèi)酰胺類的IMP和CTZ在殺菌功能方面并無差異,但在誘導(dǎo)細菌釋放LPS的能力方面CTZ> IMP;兩者間的這種差異直接影響到各自對感染動物的保護效能,提示在臨床上防治革蘭氏陰性菌感染時,選擇誘導(dǎo)細菌釋放較少LPS的抗生素(如IMP)可能更為合理。
關(guān)鍵詞 β-內(nèi)酰胺類抗生素; 革蘭氏陰性細菌; 內(nèi)毒素; 燒傷; 感染; 鱟試劑
盡管廣譜抗生素的應(yīng)用,積極的液體復(fù)蘇,及時的血管活性藥物的支持和危重癥監(jiān)護水平在不斷提高,但革蘭氏陰性細菌的感染仍然是嚴重?zé)?chuàng)傷病人主要死亡原因之一[1,2]。革蘭氏陰性菌感染難治的主要原因是其釋放的內(nèi)毒素(LPS)啟動機體不可逆轉(zhuǎn)的炎癥反應(yīng),促發(fā)膿毒癥或膿毒性休克,最終導(dǎo)致病人發(fā)生多器官功能損害或衰竭而死亡[2～ 4]。β-內(nèi)酰胺類抗生素歷來是防治革蘭氏陰性菌感染的重要手段,但國外近年來的研究表明[1,5,7～ 10],抗生素是把“雙刃劍” ,因為抗生素在殺滅細菌的同時又誘導(dǎo)革蘭氏陰性菌釋放大量的LPS,而且這種誘導(dǎo)釋放的能力因抗生素的種類而異。由于LPS是燒傷膿毒癥及膿毒性休克發(fā)病機制中的啟動因子,更為重要的是目前尚無一種確切有效而又可供臨床應(yīng)用的LPS拮抗劑,因此,各種抗生素誘導(dǎo)革蘭氏陰性菌釋放LPS能力的差異,必然最終影響其療效的優(yōu)劣。本實驗選擇目前臨床上防治革蘭氏陰性菌感染最常用兩種抗生素亞胺培南(imipenem,IMP)和頭孢他啶(ceftazidime,CTZ),探討它們在治療大鼠燒傷創(chuàng)面膿毒癥時的殺菌效能,誘導(dǎo)LPS釋放,激活炎癥介質(zhì)產(chǎn)生,以及對感染動物保護效能方面的異同,旨在為臨床上防治革蘭氏陰性菌感染時抗生素的選擇提供實驗依據(jù)。
1 材料和方法
1.1 材料
1. 1.1 細菌 銅綠假單胞菌PA103(Pseudomonasaeruginosa,PA103)第三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院燒傷研究所提供。
1.1.2 抗生素 亞胺培南(IMP),美國Merck Sharp& Dohme公司,批號V5134;頭孢他啶(CTZ),英國Glaxo Wellcome公司,批號B4166GA。
1.1.3 動物 Wistar大鼠,體重200± 20g,雌雄不限,第三軍醫(yī)大學(xué)外研所實驗動物中心提供。
1.1.4 試劑 鱟試儀專用鱟試劑,廈門鱟試劑廠,批號980225;鱟試劑溶解水,廈門鱟試劑廠,批號980125。 D-半乳糖胺(D-galactosamine,GalN)美國Sigma公司,批號117H3911。愛蘭苔膠(carrageenan,CGN),美國Sigma公司,批號127H1222。腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)及白介素6(interleu-kine-6,IL-6)放免藥盒,北京東亞免疫技術(shù)研究所提供。Griess試劑:第三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院燒傷研究所提供。
1.1.5 儀器 紫外分光光度計 自動γ-計數(shù)儀:放射免疫γ-計數(shù)儀 內(nèi)毒素自動分析儀 熒光顯微鏡: Olympus
1.2 方法
1.2.1 去熱原處理 三角錐瓶、玻璃試管、橡皮塞、吸頭,EP管等清洗干凈后60℃烘干,各自分裝后送鈷-60照射徹底去熱原。
1.2.2 PA103懸液制備 將PA103劃線接種于血瓊脂平板,37℃孵育24h,挑取單菌落轉(zhuǎn)移到普通牛肉浸膏培養(yǎng)液中,置水浴恒溫振蕩器中37℃水浴振蕩培養(yǎng)18～ 20h(頻率60次/min)。培養(yǎng)液3000r/min離心15min,棄除上清,無菌生理鹽水洗滌,再次離心棄除上清,重復(fù)洗滌1次后用無菌生理鹽水配成細菌濃度為1× 109CFU/ml的細菌懸液(光鏡計數(shù)法),異硫氰熒光素標記后,置4℃冰箱備用。
1.2.3 大鼠燒傷創(chuàng)面膿毒癥模型制作[11] 按文獻[11]進行。
1.2.4 動物分組及處理
單純抗生素治療組 將大鼠隨機(隨機表法)分為IMP治療組、CTZ治療組和對照組,每組大鼠24只。抗生素給藥方案: IMP 5mg /rat,CTZ 10mg /rat,燙傷及涂菌后72h腹腔注射,對照組注射等量無菌生理鹽水。
半乳糖胺敏化及抗生素治療組 將大鼠隨機分為IMP+ GalN組、CTZ+ GalN組和GalN+ saline組,每組大鼠10～ 12只。抗生素給藥方案同前,GalN50mg /rat,抗生素治療前1h腹腔注射。愛蘭苔膠封閉,半乳糖胺敏化及抗生素治療組 將大鼠隨機分為IMP+ GalN+ CGN組、CTZ+ GalN+ CGN組和GalN+ CGN+ saline組,每組10～ 12只大鼠。抗生素治療和GalN敏化同前,CGN 1mg /rat,抗生素治療前2d腹腔注射。
1.2.5 時相點設(shè)置和標本采集 共設(shè)置4個時相點,0h(抗生素治療前)和抗生素治療后3、6及9h,每個時相點6只大鼠。大鼠麻醉后剖腹,直視下腔靜脈穿剌采血,取血漿置于去熱原EP管中,-36℃貯存待測。
1.2.6 觀察指標與檢測方法
細菌定量培養(yǎng)及菌種鑒定 取抗凝下腔靜脈血100μl,無菌生理鹽水10倍稀釋后再取100μl于普通血瓊脂平板,L棒均勻涂布,37℃孵箱培養(yǎng)24h行菌落計數(shù),并用熒光顯微鏡檢鑒定菌種是否為種植菌PA103。
LPS測定 采用動態(tài)濁度法[12],在BET-16細菌內(nèi)毒素測定儀上進行。血漿TNF和IL-6測定 血漿標本在室溫下解凍,測定用放免法,在自動γ計數(shù)儀上進行,操作按試劑盒說明書進行。
血漿NO測定 采用Griess法[13]。
死亡率觀察 分別觀察IMP+ GalN組,CTZ+GalN組,GalN+ saline組,IMP+ GalN+ CGN組,CTZ+ GalN+ CGN組,GalN+ CGN+ saline組大鼠的死亡率,觀察期限為燙傷及涂菌后13d。
1.2.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用華西醫(yī)科大學(xué)PEMS醫(yī)學(xué)統(tǒng)計程序軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±s)表示,檢驗水準α定為0.05和0.01。
2 結(jié)果
2.1 抗生素治療后血中細菌菌量變化
燙傷及創(chuàng)面涂菌后3d,大鼠血中菌量達103～105CFU/ml。未用抗生素的對照組在各時相點菌量居高不下,而抗生素治療后各時相點血中菌量迅速減少,至用藥后9h血培養(yǎng)已轉(zhuǎn)陰,且IMP和CTZ殺菌效能相似,治療組各時相點血中細菌數(shù)量與對照組相比差異非常顯著(P<0.01,Fig.1)。
2.2 血中內(nèi)毒素水平變化
未治療組各時相點血漿LPS水平變化不明顯;IMP治療后各時相點血漿LPS逐漸升高,至9h達峰值,其中的3h及9h與治療前及未治療組同時相點相等比升高尤為明顯;與上述不同,CTZ治療后血漿LPS水平升高迅速而顯著,各時相點與用藥前及未治療組和IMP治療組同時相點相比差異顯著或非常顯著(P<0.05或P<0.01,Fig.2)。
2.3 血漿TNF的變化
未用抗生素治療組(saline組)血漿TNF水平呈緩慢降低趨勢,但各時相點差異不顯著(P> 0.05);IMP治療組各時相點血漿TNF變化不顯著,與用藥前比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05);與上述不同,CTZ治療組用藥后各時相點血漿TNF水平升高,尤以3h最為明顯,與治療前及對照組和IMP組同時相點相比差異顯著(P<0.05,Fig.3)。
2.4 血漿IL-6水平變化
2.4.1 未用抗生素治療的對照組 血漿IL-6水平變化小,各時相點間無統(tǒng)計學(xué)差異(Fig.4)。
2.4.2 抗生素治療組 IMP治療后血漿IL-6水平緩慢上升,至9h升幅最大,與治療前及對照組同時相點相比有顯著差異(P <0.05),CTZ治療后血漿IL-6水平升高的速度快,幅度大,其6、9h兩時相點與治療前及對照組和IMP組同時相點相比,均有非常顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01,Fig.4)。
2.5 血漿NO變化2.5.1 未用抗生素治療的對照組 血漿NO水平在各時相點無顯著變化(Fig.5)。
2.5.2 抗生素治療組 IMP治療后血漿NO水平呈逐漸升高趨,9h升幅最大,3、6、9h 3個時相點與生理鹽水對照組同時相點相比,均有顯著或非常顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P <0.05或P <0.01);CTZ治療后6h血漿NO水平開始升高,9h升幅最大,與治療前及生理鹽水對照組和IMP組同時相點相比,升高更為明顯,有非常顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01,Fig.5)。
2.6 大鼠死亡率
2.6.1 敏化組大鼠死亡率 3組中CTZ+ GalN組死亡率最高,GalN+ saline組次之,IMP+ GalN組最低,兩抗生素治療組之間的差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05,Tab.1)。
2.6.2 封閉組大鼠死亡率 經(jīng)CGN封閉單核-巨噬細胞系統(tǒng)后,各抗生素治療組死亡率降低,與對照組(GalN+ CGN+ saline組)相比,差異顯著(P <0.05),而CTZ和IMP組之間原先的差異消失(P> 0.05,Tab.2)。
2.7 相關(guān)分析
IMP治療的各組大鼠血中各種炎癥介質(zhì)水平與LPS水平呈顯著正相關(guān),CTZ治療組更是如此。相關(guān)分析結(jié)果見Tab.3。
3 討論
3.1 抗生素種類對誘導(dǎo)革蘭氏陰性菌釋放LPS的影響
近十年來國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),不同種類的抗生素在誘導(dǎo)革蘭氏陰性菌釋放LPS能力上存在差異[1,3～ 5,7,8]。我們的研究結(jié)果表明:同屬β-內(nèi)酰胺類的IMP和CTZ在治療銅綠假單胞菌PA103燒傷大鼠創(chuàng)面膿毒癥時均能誘導(dǎo)細菌釋放大量LPS,但無論釋放的數(shù)量,還是釋放的速度,CTZ都遠超過IMP,兩者差異非常顯著(P<0.01,Fig.2)。提示IMP可能在治療燒傷后革蘭氏陰性菌感染時會誘導(dǎo)較少的內(nèi)毒素釋放,從而對防止或減輕致死性的內(nèi)毒素血癥有益。不同抗生素在誘導(dǎo)革蘭氏陰性菌釋放LPS能力上的差異,與其對細菌胞壁上不同青霉素結(jié)合蛋白(Penicillin Binding Proteins,PBPs)的親和性有關(guān)。國外研究已證實[1,10]:凡是與PBP3親和性高的抗生素,可誘導(dǎo)細菌產(chǎn)生絲狀改變,釋放較多的LPS,原因是此類抗生素可抑制細菌分裂,而細菌胞壁不斷生長延長從而導(dǎo)致LPS不斷釋放。而與PBP2親和性高的抗生素,誘導(dǎo)細菌產(chǎn)生球狀變,由于球狀體比同等質(zhì)量的柱狀體幾何面積小,加之球狀體胞壁合成受抑,從而導(dǎo)致LPS合成和釋放減少。 IMP屬于PBP2高親和性,CTZ屬于PBP3高親和性,這是兩者在誘導(dǎo)革蘭氏陰性菌釋放LPS能力差異的根本原因。
3.2 血中LPS水平與炎癥介質(zhì)水平間的關(guān)系
國內(nèi)外學(xué)者已公認: LPS是致死性炎癥級聯(lián)反應(yīng)中的啟動因子之一[2],抗生素對革蘭氏陰性菌的快速殺菌作用導(dǎo)致內(nèi)毒素大量釋放和產(chǎn)生TNF[6]。 TNF、IL-6和NO等則是介導(dǎo)膿毒癥及膿毒性休克發(fā)生和發(fā)展的重要介質(zhì)[3],LPS釋放、炎癥介質(zhì)產(chǎn)生、膿毒癥及膿毒性休克發(fā)生和發(fā)展是三位一體的關(guān)系[14]。我們的研究結(jié)果及相關(guān)分析表明:與IMP相比,CTZ治療大鼠燒傷創(chuàng)面膿毒癥時,血中LPS、TNF及IL-6和NO水平較高(Fig.2～ 5),高水平的LPS與高水平的炎癥介質(zhì)之間關(guān)系密切(Tab.3),提示在治療膿毒癥及膿毒性休克時應(yīng)盡量避用誘導(dǎo)革蘭氏陰性菌釋放較多LPS的抗生素(如CTZ)。
3.3 抗生素誘導(dǎo)革蘭氏陰性菌LPS釋放與抗生素療效間的關(guān)系
為了進一步探討IMP和CTZ在誘導(dǎo)LPS釋放及炎癥介質(zhì)產(chǎn)生方面差異的病理生理學(xué)意義,我們在實驗中設(shè)計了對燒傷膿毒癥大鼠的敏化實驗和封閉實驗。半乳糖胺(GalN)是一種可逆性肝細胞毒性物質(zhì),通過抑制肝細胞蛋白質(zhì)合成來阻斷肝臟的解毒功能,可顯著提高大鼠對LPS的敏感性[13]。實驗結(jié)果表明:經(jīng)GalN敏化的CTZ治療組大鼠的死亡率遠高于敏化后IMP治療組的死亡率,兩者差異非常顯著(P <0.01,見Tab.1)。愛蘭苔膠(CGN)是一種從海藻中提取的多糖類化合物,可選擇性封閉肝臟及腹腔單核-巨噬細胞系統(tǒng)對LPS的生物學(xué)效應(yīng),減少TNF及IL-6等炎性介質(zhì)的產(chǎn)生。我們在實驗中發(fā)現(xiàn),預(yù)先用CGN封閉后,同樣敏化的燒傷創(chuàng)面膿毒癥大鼠死亡率明顯降低,而且,IMP和CTZ治療組間的差異消失(Tab.2),這進一步說明:盡管IMP和CTZ殺菌功能相同,但由于各自誘導(dǎo)革蘭氏陰性菌釋放LPS及激活炎癥介質(zhì)產(chǎn)生的能力不同,結(jié)果導(dǎo)致對感染動物的保護效能也不同,提示抗生素誘導(dǎo)革蘭氏陰性菌釋放LPS的能力對其療效有直接影響。
簡言之,根據(jù)我們的研究得出如下初步結(jié)論:
(1)同屬β-內(nèi)酰胺類的IMP和CTZ在對銅綠假單胞菌PA103殺菌效能方面并無明顯差異;
(2)IMP和CTZ在殺菌的同時可誘導(dǎo)革蘭氏陰性菌釋放大量的LPS,釋放能力CTZ>IMP;
(3)過量的LPS與高水平炎癥介質(zhì)(如TNF、IL-6及NO等)的產(chǎn)生關(guān)系密切;
(4)IMP和CTZ在誘導(dǎo)革蘭氏陰性菌釋放LPS方面的差異,直接影響到各自對感染動物的保護效能;
(5)由于上述原因,故在臨床上治療革蘭氏陰性菌感染所致的膿毒癥或膿毒性休克時,選擇誘導(dǎo)細菌釋放較少LPS的抗生素(如IMP)可能更為合理。
參考文獻（略）
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